黑豆萌芽水提物抗氧化活性研究及其机理初探

【摘要】黑豆(Glycinemaxvar)为豆科植物大豆(Glycinemax(L.)merr)的黑色种子，又名橹豆、乌豆、黑大豆、马料豆。黑豆味甘性平，具有高蛋白、低热量的特性，是一种药食同源的豆类，在安徽、东北、河南、河北、山东、陕西等省均有种植。黑豆萌芽，俗称“大豆卷”，具有补肾、利尿消肿、滋阴壮阳、助消化、降血脂和软化血管等功效。本论文以黑豆萌芽为研究对象，对其萌发过程和抗氧化活性进行了系统研究，分析了与其抗氧化活性相关基因的表达，初步探讨了黑豆萌芽水提物（BlackSoybeanSproutsExtract,BSSE）抗氧化活性的产生机理。（1）BSSE抗氧化活性研究：通过清除自由基，抑制酶活性和抗细胞氧化损伤三个方面系统研究了BSSE的抗氧化活性。结果表明：0-10cm芽长的BSSE（40mg/mL）对DPPH自由基和羟基自由基均有优异的清除作用，清除率均在90%以上，与同浓度的Vc相当，其中萌动期（0.5cm芽长）的BSSE的清除率高于其它芽长；0-10cm芽长BSSE（40mg/mL）对酪氨酸酶的抑制率可达90%左右，与同浓度的熊果苷接近，表明BSSE对酪氨酸酶有强抑制作用，其中萌动期（芽长0.5cm）BSSE活性最强；人皮肤成纤维细胞与BSSE孵育24h后，再与H2O2反应，能够显著抵抗H2O2引起的细胞损伤（p<0.05），芽长为0.5cm，1cm，2cm时，细胞的存活率较高。三个方面的研究结果都表明BSSE具有抗氧化活性，且萌动期活性优于干种子和其它芽长，说明适当的萌芽过程可以提高黑豆的抗氧化活性。（2）基因角度的机理研究：采用基因芯片技术，研究不同芽长黑豆萌芽的基因表达差异，结果表明：0.5cm芽长与5cm芽长黑豆萌芽的基因表达存在显著差异；GOterm分析结果表明：在0.5cm的黑豆萌芽中总共有918个基因上调表达，其中属于GO:0006979（氧化压力响应）的10个基因显著高表达，这些基因主要调控热激蛋白和抗氧化酶类的合成，这些酶类与保持细胞氧化还原代谢平衡有密切关系；RT-PCR验证结果证明：基因芯片数据和RT-PCR验证结果一致，GO:0006979（氧化压力响应）的10个基因在0.5cm的黑豆萌芽中确实显著高表达。研究发现：萌发过程确实影响了黑豆基因的表达，调动了与抗氧化活性相关的基因显著高表达，产生了更多、活性更强的物质，提高了0.5cm芽长黑豆萌芽的抗氧化活性，从基因层面初步阐释了黑豆萌芽抗氧化活性增强的机理。（3）主要成分分类研究结果表明，BSSE的主要成分是蛋白质和多糖，基本不含黄酮类物质；主要成分的抗氧化活性实验表明，BSSE中的蛋白质是主要的抗氧化功效成分，多糖也具有优异的抗氧化活性；SDS-PAGE法测定蛋白质的分子量主要集中在三个范围：20.0ku以下；26.0-45.0ku；66.2-94.0ku，其中20.0ku以下的蛋白质清除自由基活性最强；MALLS/GPC法测定多糖的分子量主要分布在17.9-36.0ku之间，其中23.0ku多糖组分的抗氧化活性最优，说明低分子量的黑豆萌芽蛋白质和多糖具有更强的抗氧化活性。（4）响应面法优化提取工艺：在单因素实验的基础上，采用响应面法研究了黑豆萌芽中抗氧化活性成分提取工艺中的主要独立变量的相互作用，获得黑豆萌芽中抗氧化物质的最佳提取工艺为：超声提取时间32.13min；提取温度30℃；液料比29.19:1。根据最优提取条件，提取液对DPPH自由基的实际清除率可达67.60%，与理论预测值66.36%非常相近，优化的提取工艺提高了水提物的抗氧化活性。本实验优化得出的黑豆萌芽提取工艺，为开发利用黑豆资源提供了基础。（5）采用红细胞（RBC）溶血实验、鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）实验和人体皮肤斑贴实验对BSSE的安全性进行研究，结果显示：RBC溶血率均低于10%，CAM模型未达到显著性差异（P＞0.05），人体皮肤斑贴实验全部评定为0级反应，表明BSSE对眼睛和人体皮肤都是安全无刺激的；稳定性研究的结果显示：BSSE适宜的pH环境为6~10之间，可以耐热、耐寒、耐光照，在常温和冷热交替的条件下，都可以保持理化性质、主要成分和抗氧化活性的稳定；防腐挑战实验第14天即无微生物检出，证实防腐体系稳定可靠；产品适用性研究表明，BSSE可以添加在膏霜、乳液和啫喱等剂型的化妆品中，以及50%以下浓度的酒精体系中，不建议用于水剂化妆品。研究结果表明BSSE是一款安全、稳定、有效、普适的化妆品功效添加剂。
【作者】来吉祥；
【导师】魏少敏；
【作者基本信息】江南大学，应用化学，2014，博士
【关键词】黑豆萌芽；抗氧化活性；基因芯片技术；机理；提取工艺优化；响应面法；活性成分；安全性；稳定性；

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